藥品領域的微生物檢測

微生物限度檢查法係檢查非規定滅菌製劑及其原料、輔料受微生物汙染程度的方法。檢查項目包括細菌數、黴菌數、酵母菌數及控製菌檢查。
儀(yi) 器有微生物限度檢查儀(yi) ，集菌儀(yi) 、無菌集菌器
微生物限度檢查應在環境潔淨度10000級下的局部潔淨度 100級的單向流空氣區域內(nei) 進行。檢驗全過程必須嚴(yan) 格遵守無菌操作，防止再汙染，防止汙染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區域、工作台麵及環境應定期按《醫藥工業(ye) 潔淨室（區）懸浮粒子、浮遊菌和沉降菌的測試方法》的現行國家標準進行潔淨度驗證。
供試品檢查時，如果使用了表麵活性劑、中和劑或滅活劑，應證明其有效性及對微生物無毒性。
除另有規定外，本檢查法中細菌及控製菌培養(yang) 溫度為(wei) 30℃～35℃；黴菌、酵母菌培養(yang) 溫度為(wei) 23℃～28℃。
檢驗結果以 1g、1ml、10g、10ml或10cm2 為(wei) 單位報告，特殊品種可以小包裝單位報告。
檢驗量
檢驗量即一次試驗所用的供試品量（g、ml 或cm2）。
除另有規定外，一般供試品的檢驗量為(wei) 10g 或10ml；膜劑為(wei) 100cm2；貴重藥品、微量包裝藥品的檢驗量可以酌減。要求檢查沙門菌的供試品，其檢驗量應增加20g 或20ml（其中10g或10ml用於(yu) 陽性對照試驗）。
檢驗時，應從(cong) 2 個(ge) 以上小包裝單位中抽取供試品，膜劑還不得少於(yu) 4 片。
一般應隨機抽取不少於(yu) 檢驗用量（兩(liang) 個(ge) 以上小包裝單位）的3 倍量供試品。
供試液的製備
根據供試品的理化特性與(yu) 生物學特性，采取適宜的方法製備供試液。供試液製備若需加溫時，應均勻加熱，且溫度不應超過45℃。供試液從(cong) 製備至加入檢驗用培養(yang) 基，不得超過1 小時。
除另有規定外，常用的供試液製備方法如下。
1.液體(ti) 供試品
取供試品10ml，加pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝(chong) 液至100ml，混勻，作為(wei) 1∶10 的供試液。油劑可加入適量的無菌聚山梨酯80 使供試品分散均勻。水溶性液體(ti) 製劑也可用混合的供試品原液作為(wei) 供試液。
2.固體(ti) 、半固體(ti) 或黏稠性供試品
取供試品10g，加pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝(chong) 液至100ml，用勻漿儀(yi) 或其他適宜的方法，混勻，作為(wei) 1∶10 的供試液。必要時加適量的無菌聚山梨酯80，並置水浴中適當加溫使供試品分散均勻。
3.需用特殊供試液製備方法的供試品
(1)非水溶性供試品
方法1 取供試品5g（或5ml），加至含溶化的（溫度不超過45℃）5g 司盤80、3g 單硬脂酸甘油酯、10g 聚山梨酯80 無菌混合物的燒杯中，用無菌玻棒攪拌成團後，慢慢加入45℃的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝(chong) 液至100ml，邊加邊攪拌，使供試品充分乳化，作為(wei) 1∶20 的供試液。
方法2 取供試品10g，加至含20ml 無菌十四烷酸異丙酯（采用薄膜過濾法過濾除菌。選用孔徑為(wei) 0.22μm的脂溶性濾膜，在140℃幹熱滅菌2小時）和無菌玻璃珠的適宜容器中，必要時可增加十四烷酸異丙酯的用量，充分振搖，使供試品溶解。然後加入45℃的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝(chong) 液100ml，振搖5～10 分鍾，萃取，靜置使油水明顯分層，取其水層作為(wei) 1∶10 的供試液。
(2)膜劑供試品
取供試品100cm2，剪碎，加100ml 的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝(chong) 液（必要時可增加稀釋液），浸泡，振搖，作為(wei) 1∶10 的供試液。
(3)腸溶及結腸溶製劑供試品
取供試品10g，加pH6.8 無菌磷酸鹽緩衝(chong) 液（用於(yu) 腸溶製劑）或pH7.6 無菌磷酸鹽緩衝(chong) 液（用於(yu) 結腸溶製劑）至100ml，置45℃水浴中，振搖，使溶解，作為(wei) 1∶10 的供試液。
(4)氣霧劑、噴霧劑供試品
取規定量供試品，置冰凍室冷凍約1 小時，取出，迅速消毒供試品開啟部位，用無菌鋼錐在該部位鑽一小孔，放至室溫，並輕輕轉動容器，使拋射劑緩緩全部釋出。用無菌注射器吸出全部藥液，加至適量的pH7.0 無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝(chong) 液（若含非水溶性成分，加適量的無菌聚山梨酯80）中，混勻，取相當於(yu) 10g或10ml 的供試品，再稀釋成1∶10 的供試液。
(5)貼劑供試品
取規定量供試品，去掉貼劑的保護層，放置在無菌玻璃或塑料片上，粘貼麵朝上。用適宜的無菌多孔材料（如無菌紗布）覆蓋貼劑的粘貼麵以避免貼劑粘貼在一起。然後將其置於(yu) 適宜體(ti) 積並含有表麵活性劑（如聚山梨酯80 或卵磷脂）的稀釋劑中，用力振蕩至少30 分鍾，製成供試液。貼劑也可以其他適宜的方法製備成供試液。
(6)具抑菌活性的供試品
當供試品有抑菌活性時，采用下列方法進行處理，以消除供試液的抑菌活性後，再依法檢查。常用的方法如下。
①培養(yang) 基稀釋法 取規定量的供試液，至較大量的培養(yang) 基中，使單位體(ti) 積內(nei) 的供試品含量減少，至不含抑菌作用。測定細菌、黴菌及酵母菌的菌數時，取同稀釋級的供試液2ml，每1ml 供試液可等量分注多個(ge) 平皿，傾(qing) 注瓊脂培養(yang) 基，混勻，凝固，培養(yang) ，計數。每1ml 供試液所注的平皿中生長的菌數之和即為(wei) 1ml的菌落數，計算每1ml 供試液的平均菌落數，按平皿法計數規則報告菌數；控製菌檢查時，可加大增菌培養(yang) 基的用量。
②離心沉澱法 取一定量的供試液， 500 轉/分鍾離心3 分鍾，取全部上清液混合，用於(yu) 細菌檢查。
③薄膜過濾法 見細菌、黴菌及酵母菌計數項下的“薄膜過濾法”。使用的設備集菌儀(yi) 或者在微生物限度檢查儀(yi)
④中和法 凡含汞、砷或防腐劑等具有抑菌作用的供試品，可用適宜的中和劑或滅活劑消除其抑菌成分。中和劑或滅活劑可加在所用的稀釋液或培養(yang) 基中。
細菌、黴菌及酵母菌計數
計數培養(yang) 基的適用性檢查
細菌、黴菌及酵母菌計數用的培養(yang) 基應進行培養(yang) 基的適用性檢查，成品培養(yang) 基、由脫水培養(yang) 基或按培養(yang) 基處方配製的培養(yang) 基均應檢查。
菌種 試驗用菌株的傳(chuan) 代次數不得超過5 代（從(cong) 菌種保存中心獲得的冷凍幹燥菌種為(wei) 第0 代）。並采用適宜的菌種保藏技術進行保存，以保證試驗菌株的生物學特性。
大腸埃希菌（Escherichia coli）〔CMCC（B） 44 102〕
金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）〔CMCC（B） 26 003〕
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）〔CMCC（B） 63 501〕
白色念珠菌（Candida albicans）〔CMCC（F） 98 001〕
黑曲黴（Aspergillus niger）〔CMCC（F） 98 003〕
菌液製備 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鮮培養(yang) 物至營養(yang) 肉湯培養(yang) 基或營養(yang) 瓊脂培養(yang) 基中，培養(yang) 18～24 小時；接種白色念珠菌的新鮮培養(yang) 物至改良馬丁培養(yang) 基或改良馬丁瓊脂培養(yang) 基中，培養(yang) 24～48 小時。上述培養(yang) 物用0.9%無菌氯化鈉溶液製成每1ml 含菌數為(wei) 50～100cfu 的菌懸液。接種黑曲黴的新鮮培養(yang) 物至改良馬丁瓊脂斜麵培養(yang) 基中，培養(yang) 5～7 天，加入3～5ml 含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80 的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然後，采用適宜方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nei) ，用含0.05％（ml/ml）聚山梨酯80 的0.9%無菌氯化鈉溶液製成每1ml 含孢子數50～100cfu 的孢子懸液。
菌懸液在室溫下放置應在2 小時內(nei) 使用，若保存在2～8℃可在24 小時內(nei) 使用。黑曲黴孢子懸液可保存在2～8℃，在驗證過的貯存期內(nei) 使用。
適用性檢查 取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各50～100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾(qing) 注營養(yang) 瓊脂培養(yang) 基，每株試驗菌平行製備2 個(ge) 平皿，混勻，凝固，置30～35℃培養(yang) 48 小時，計數；取白色念珠菌、黑曲黴各50～100cfu，分別注入無菌平皿中，立即傾(qing) 注玫瑰紅鈉瓊脂培養(yang) 基，每株試驗菌平行製備2個(ge) 平皿，混勻，凝固，置23～28℃培養(yang) 72 小時，計數；取白色念珠菌50～100cfu，注入無菌平皿中，立即傾(qing) 注酵母浸出粉腖葡萄糖瓊脂培養(yang) 基，平行製備2 個(ge) 平皿，混勻，凝固，置23～28℃培養(yang) 72 小時，計數。同時，用相應的對照培養(yang) 基替代被檢培養(yang) 基進行上述試驗。
結果判定 被檢培養(yang) 基上的菌落平均數與(yu) 對照培養(yang) 基上的菌落平均數的比值大於(yu) 70%，且菌落形態大小應與(yu) 對照培養(yang) 基上的菌落一致，判該培養(yang) 基的適用性檢查符合規定。